Los anticuerpos secundarios pueden clasificarse según su especificidad, que puede ser amplia o estrecha, y su tipo de fragmento, que puede ser completo, F(ab) o F(ab')2.

El principio de F(ab')2 es generar fragmentos de anticuerpos divalentes que retienen las porciones Fab de unión al antígeno de los anticuerpos IgG completos mientras se elimina la mayor parte de la región Fc.

Los fragmentos F(ab')2 se generan mediante digestión con pepsina de los anticuerpos IgG completos para cortar la región bisagra y dejar intacta parte de la región Fc. Los fragmentos resultantes tienen dos porciones Fab de unión al antígeno unidas por puentes disulfuro, lo que los hace divalentes con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. El uso de fragmentos F(ab')2 tiene varias ventajas sobre los anticuerpos IgG completos, incluyendo una mejor penetración en los tejidos, una menor unión no específica a los receptores Fc en células vivas o a la proteína A/G, y la capacidad de precipitar antígenos. Sin embargo, los fragmentos F(ab')2 no se recomiendan para bloqueo, ya que tienen dos sitios de unión que están disponibles para capturar el anticuerpo primario que se introduzca posteriormente. La preparación de los fragmentos F(ab')2 implica la digestión con pepsina de los anticuerpos IgG completos, seguida de purificación mediante técnicas como FPLC con DEAE-