1. Defina exatamente o que precisa de detetar

Identifique o alvo utilizando o seu nome de gene/proteína e um identificador de acesso sempre que possível. Decida se precisa de proteína total, de uma isoforma específica, de um produto de clivagem ou de uma modificação pós-traducional específica. Para um anticorpo fosfoespecífico, especifique o resíduo e o contexto de sequência relevante.

Verifique o imunogénio e o epítopo mapeado, quando divulgados, face à forma proteica presente no seu modelo. Um anticorpo que reconhece uma região partilhada pode detetar várias isoformas; uma região ausente numa proteína truncada não pode reportar essa forma. Uma descrição do imunogénio isoladamente não demonstra especificidade numa amostra complexa. [4] [7]

Verificação de seleção: distinga o que o anticorpo é anunciado para reconhecer daquilo que os dados experimentais estabelecem de facto.

2. Separe a reatividade da espécie alvo da espécie hospedeira do anticorpo

A espécie alvo descreve a origem do antigénio; a espécie hospedeira descreve o organismo em que o anticorpo foi originalmente gerado. Um anticorpo gerado em coelho pode reconhecer uma proteína humana. Verifique a reatividade testada com a sua espécie alvo e distinga a evidência experimental das previsões baseadas em sequências.

Em modelos transfetados, especifique tanto a proteína introduzida como a espécie de fundo. Para deteção indireta em tecido, considere as imunoglobulinas endógenas: utilizar um primário de rato em tecido de rato, por exemplo, pode produzir fundo quando um secundário anti-rato também deteta as imunoglobulinas tecidulares. Espécies hospedeiras alternativas ou uma estratégia de coloração adequada da mesma espécie podem ser necessárias. [4]

Verificação de seleção: avalie o reconhecimento do alvo e a compatibilidade com o sistema de deteção como duas decisões separadas.

3. Avalie evidências específicas da aplicação, e não apenas um rótulo de validação

Inspecione as imagens reais, os controlos, a identidade da amostra e o protocolo que apoiam a referência. Um produto validado em Western blot não fica por isso validado em IHC ou citometria de fluxo; mesmo dentro de uma única aplicação, o desempenho depende do contexto da amostra e das condições do ensaio. [1] [2]

Prefira evidências que demonstrem a deteção do alvo endógeno numa amostra relevante, apoiadas por uma estratégia de especificidade adequada. O antigénio purificado ou dados de sobrexpressão podem ser informativos, mas isoladamente podem não estabelecer uma deteção seletiva a níveis de expressão endógena. O uso publicado é útil quando os métodos e controlos correspondem às suas necessidades; a contagem de citações isoladamente é insuficiente. [4] [7]

Verificação de seleção: pergunte qual a evidência que suporta exatamente o clone ou preparação, espécie e aplicação que pretende utilizar.

4. Ajuste a acessibilidade do epítopo à preparação da amostra

A preparação pode mascarar, expor ou alterar epítopos. Compare o seu protocolo com as condições utilizadas para caracterizar o anticorpo, em vez de confiar apenas na abreviatura da aplicação. [5]

IHC: distinga tecido FFPE de tecido congelado e compare o fixador, as condições de fixação e a recuperação de antigénios. Western blot: verifique a compatibilidade com condições desnaturantes versus nativas, aquecimento e redução. [4] [7] Citometria de fluxo: a coloração de superfície em células vivas requer um epítopo extracelular acessível. [8] A coloração intracelular convencional utiliza geralmente fixação e permeabilização; selecione um clone e conjugado compatíveis com essas condições. [8]

Verificação de seleção: procure dados obtidos com uma preparação comparável; o uso bem-sucedido num formato de amostra não estabelece adequação para todos os outros formatos.

5. Escolha o clone e o formato de produção para o seu experiemento

Uma preparação monoclonal deriva de um único clone de anticorpo; as preparações policlonais contêm anticorpos contra múltiplos epítopos. Os policlonais podem fornecer uma deteção útil de múltiplos epítopos, mas as preparações de origem animal podem variar entre lotes. Nem a monoclonalidade nem um sinal forte garantem a ausência de ligação fora do alvo. [4]

Recombinante descreve a produção a partir de sequências codificantes de anticorpos, e não uma categoria de clonalidade separada. Os reagentes recombinantes definidos por sequência apoiam a renovação e a engenharia de um anticorpo definido, mas continuam a exigir caracterização específica do ensaio. Considere o clone exato e o formato conjugado, a continuidade do fornecimento e evidências de consistência entre lotes. [6]

Verificação de seleção: priorize dados de desempenho relevantes em detrimento de uma preferência genérica por produtos monoclonais, policlonais ou recombinantes.

6. Selecione o formato de deteção como parte do ensaio completo

Para deteção indireta, confirme se o secundário reconhece a espécie hospedeira e a classe/subclasse de imunoglobulina do primário conforme necessário. Numa coloração multiplex, verifique a reatividade cruzada entre reagentes de deteção e os outros primários, utilizando controlos de omissão devidamente desenhados. [3] Se marcar o primário você mesmo, verifique se a sua formulação é compatível com a química de conjugação escolhida. [4]

Na citometria de fluxo, escolha a combinação de clone e fluoróforo tendo em conta o instrumento, a expressão do antigénio e outros marcadores do painel. A sobreposição espectral e o espalhamento afetam a resolução; o brilho isoladamente não é uma regra de seleção suficiente. Confirme a compatibilidade com a fixação/permeabilização. Utilize controlos de coloração única adequados para compensação ou desmistura espectral, e controlos FMO quando úteis para a colocação de portas (gates). [8]

Verificação de seleção: as evidências para um anticorpo não conjugado não substituem a avaliação do conjugado no painel final.

7. Planeie a validação complementar, controlos e titulação

O modelo de cinco pilares foi proposto por Uhlén et al. e subsequentemente adaptado por Edfors et al. para Western blot. Estas são opções complementares, e não cinco testes obrigatórios para cada anticorpo. Selecione estratégias exequíveis que respondam à questão de especificidade relevante no seu ensaio. [1] [2] [10]

• Estratégias genéticas: compare o sinal após knockout ou knockdown do alvo. Limite: depleção incompleta, isoformas residuais ou efeitos biológicos da disrupção génica podem dificultar a interpretação.
• Estratégias ortogonais: compare a leitura do anticorpo com uma medição independente do anticorpo em amostras adequadas. Limite: a correlação isolada pode ser enganosa; a abundância de ARNm não é intercambiável com a abundância proteica.
• Anticorpos independentes: compare anticorpos que reconhecem epítopos diferentes e não sobrepostos. Limite: a concordância não é conclusiva se os reagentes partilharem reatividade fora do alvo ou tiverem epítopos mal caracterizados.
• Estratégias de proteína etiquetada / expressão recombinante: avalie o reconhecimento de um alvo expresso identificado de forma independente. Limite: as tags e a sobrexpressão podem alterar a abundância, localização ou acessibilidade do epítopo e podem não representar a proteína endógena.
• Inmunocaptura seguida de espectrometria de massa: identifique proteínas enriquecidas pelo anticorpo. Limite: proteínas associadas podem co-purificar; o desempenho da captura não estabelece especificidade em tecido fixado ou num blot.

A adaptação de Western blot de Edfors inclui análise de capture-MS baseada em gel de proteínas que migram na posição detetada. Isto não deve ser confundido com imunoprecipitação-MS, e a comigração ou sensibilidade limitada de MS podem restringir a interpretação. A validação continua a ser específica da aplicação e do contexto. [1] [2] [10]

Inclua amostras alvo-positivas e alvo-negativas. Para Western blot, a massa de banda esperada isoladamente não é prova de especificidade; bandas adicionais podem refletir isoformas, processamento ou modificações. [7] Para IHC/IF, os controlos sem primário testam o fundo de deteção/secundário, e não a especificidade do primário omitido. [3] Para citometria de fluxo, os controlos FMO apoiam a colocação de portas, mas não estabelecem especificidade do alvo. [8]

Titre o reagente em amostras representativas em vez de tratar uma diluição da ficha técnica como universal. Otimize uma separação útil com fundo aceitável, e não simplesmente o sinal mais forte. Registe o fornecedor, número de catálogo, clone, lote, conjugado, RRID quando disponível e protocolo final; reavalie após alterações relevantes de reagente ou protocolo. [9] [7]

Verificação de seleção: defina tanto a evidência que uma estratégia de validação pode fornecer como a incerteza que deixa por resolver.