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Protocolo Western blot

Protocolo Western blot

 

Produtos necessários:
Preparação e separação de proteínas por electroforese em gel
  1. Retirar um pequeno volume de amostra de proteínas para determinar a concentração de proteínas
  2. Tomar 20 µg de proteínas e adicionar Laemmli
  3. Ferver 5 minutos a 95°C, depois centrifugar os tubos
  4. Colocar volumes iguais de proteínas nos poços do gel de SDS-PAGE (a percentagem de acrilamida depende do tamanho da proteína-alvo), sem esquecer um poço para as escadas de peso de controlo.
  5. Migração a amperagem constante com tampão adequado

Transferência de proteínas do gel para a membrana
  1. Colocar a sanduíche (gel/membrana/ papel mata-borrão) na caixa de transferência e certificar-se de que não existem bolhas de ar
  2. Transferência a tensão constante com o tampão adequado


Incubação e revelação de anticorpos
  1. Corar a membrana com vermelho de Ponceau para verificar a qualidade da transferência de proteínas
  2. Retirar a membrana e incubar em solução de bloqueio
  3. Incubar durante a noite com o anticorpo primário a 4°C
  4. Rince a mancha
  5. Incubar com o anticorpo secundário durante 1 hora à temperatura ambiente
  6. Rince, a membrana
  7. Aplicar o substrato na mancha