Protocolo para citometria de fluxo em sangue total

I. Material necessário
Reagentes
- Um anticorpo primário , contra a molécula alvo
- Um  anticorpo secundário em casos de coloração indirecta com um anticorpo primário não marcado
- Um isótipo de controlo não relevante com um rótulo semelhante ao do anticorpo primário

Amortecedores
- Um tampão de coloração
- A Tampão de lise dos glóbulos vermelhos (RBC)
- Um tampão de fixação intracelular
- Azul de Tripan para contagem de células
- Fluido da bainha de Gaines

Material
- Pipetas e Pipet-aid
- Centrifugador
- Congelador
- Citómetro de fluxo


II. Duração da experimentação
- 30 mn preparação de amostras e diluições de anticorpos
- 30 mn a 1 h de incubação do anticorpo
- 30 minutos a 1 hora de leitura de amostras com o citómetro de fluxo (depende do número de amostras, da concentração de células e da capacidade do citómetro)
- TOTAL : 3 a 4 horas


III. Protocolo
- Diluir o anticorpo primário e o isótipo de controlo em 50 µl de tampão de ensaio, de modo a respeitar a concentração desejada, optimizada após a titulação dos anticorpos
- Incubar 50 µl de preparação de células em 50 µl de preparação de anticorpos ou isótipo de controlo numa placa de 96 poços
- Incubar durante 15-30 mn a 4°c numa sala escura

Nota : É necessário optimizar o tempo de incubação do anticorpo em função da sua afinidade com o antigénio.

- Adicionar 200 µl de tampão de ensaio para parar a reacção
- Centrifugar as células em suspensão durante 5 mn (300 - 400g) a +4°c e rejeitar o sobrenadante
- Repetir duas vezes as etapas de lavagem com 200 µl de tampão de ensaio - Centrifugar a suspensão de células durante 5 min (300 - 400g) a 4°c

Opcional: Para a coloração indirecta, repetir a etapa de coloração com anticorpo secundário com o mesmo protocolo e observações semelhantes
- Ressuspender em 2 ml de tampão de lise de hemácias e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente

- Adicionar 2 ml de tampão de ensaio para parar a reacção

- Centrifugar a suspensão de células durante 5 mn (300 - 400g) a 4°c e rejeitar o sobrenadante
- Repetir duas vezes os passos de lavagem em 2 ml de tampão de ensaio
- Ressuspender em 500 µl de tampão de ensaio ou de tampão de fixação suplementado com 2% de formaldeído
- Ler células num citómetro de fluxo


IV. Motores de pesquisa
-  Anticorpos primários
-  Anticorpos secundários